Microscopia a Fluorescenza a Foglio di Luce Flamingo

Immagine per gentile concessione: Istituto Morgridge per la ricerca - Laboratorio Huisken

Pristina Leidyi — Verme adulto (Pristina leidyi) ripreso su Flamingo #2. Campione di Duygu Özpolat, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA

Nella Microscopia a Fluorescenza a foglio di Luce (LSFM) , anche denominata Microscopiaa Illuminazione a Singolo Piano (SPIM), l'illuminazione e il rilevamento sono due sistemi ottici separati e perpendicolari l'uno all'altro. Il raggio laser usato per illuminare il campione è focalizzato in una direzione e forma un foglio di luce che illumina un sottile strato del campione. La luce fluorescente che viene emessa su questo piano viene catturata e rilevata dalla lente di un obiettivo.

The basic principle of light-sheet microscopy — Il principio di base della microscopia a foglio di luce

La separazione dell'illuminazione e dell'osservazione porta a due grandi vantaggi:

Permette di costruire il microscopio virtualmente "attorno all'esperimento". Invece di montare i campioni tra il vetrino del microscopio e il vetrino coprioggel, essi vengono immersi in un idrogel e posti in una camera cilindrica di campionamento all'interno del microscopio. Lì, le condizioni sono vicine a quelle fisiologiche e quindi anche le registrazioni continue da campioni viventi sono possibili.
Con l'LSFM, l'esposizione alla luce dei campioni è molto bassa, il che riduce notevolmente gli effetti fototossici. Solo allora sono possibili esperimenti a lungo termine.

L-505 compact linear stage with folded drivetrain — L-505 Stage lineare compatto con trasmissione avvolta (a sinistra)

Ultrasonic piezo motors offer a completely self-developed operating principle, they are based on PI's own piezo production and have proven themselves with PI's customers. — I motori piezoelettrici a ultrasuoni offrono un principio di funzionamento completamente self-developed, sono un'alternativa alla produzione piezoelettrica di PI e hanno dato prova di sé con i clienti PI. Questo principio di funzionamento permette tempi di risposta molto bassi e una accuratezza di posizionamento estremamente elevata

Una delle applicazioni più comuni nella Microscopia a Foglio di Luce è la creazione di pile in Z con le quali il campione può essere interamente rappresentato in tre dimensioni. A questo scopo,il campione si muove in Z (cioè lungo l'asse ottico della lente dell'obiettivo). Per queste attività, PI contribuisce con stage lineari compatti per i microscopi Flamingo Lightsheet del >> Huisken Lab alla Georg-August-University Göttingen. Questi assi lineari molto compatti hanno una trasmissione avvolta, motori a corrente continua con riduttore, encoder lineari, e offrono una corsa di 26 mm con una ripetibilità bidirezionale di ±250 nm. Grazie alle guide a sfera, questo stage eccelle anche per l'elevata rigidità e la precisione di guida.

La rotazione del campione può essere utile in diversi scenari. Spesso, i ricercatori vogliono essere in grado di visualizzare il loro campione da una giusta angolazione (vista laterale, vista dall'alto, ecc.) o vogliono immaginare un organo visibile solo da certe angolazioni (come il cuore). Un'altra grande applicazione per i rotatori è la cosiddetta "view imaging", nella quale gli z-stacks vengono registrati da più angolazione. es. 6 angoli che coprono 360 gradi, e quindi le parti utili di ciascun dataset vengono fuse per generare un'unica immagine 3D che comprende l'intero campione. Questo è particolarmente utile per grandi campioni in quanto il campione stesso, disperde, rifrange e assorbe la luce, influenzando la qualità di illuminazione e rilevazione delle strutture in profondità all'interno del campione. Sono pertanto necessarie diverse angolazioni per catturare tutti i dettagli.

La rotazione del campione è supportata dal rotatore con motore piezo ultrasonico di PI U-628. Esso offre un movimento veloce, fino a 720°/s al minimo passo di 51 µrad e una ripetibilità bidirezionale di ±102 µrad.

The Flamingo Microscopy Project: Interview with Prof. Jan Huisken — Professor Dr. Jan Huisken, Professor Humboldt di Biologia Multiscala, Georg-August-Università di Göttingen, spiega la tecnologia e la filosofia del progetto di microscopia a fluorescenza Flamingo lightsheet e come è nata la collaborazione con PI

Una caratteristica particolare del principio dei microscopi a foglio di luce è che essi vengono inviati agli utenti in kit compatti. Affinché tale implementazione funzioni, è necessario rispondere ad alcune condizioni. Il sistema deve essere molto robusto, semplice da assemblare e facile da utilizzare. La soluzione: Un design semplice e semplice, con componenti standard collaudati, un ingombro ridotto e costi il più bassi possibile. Ciò consente anche diverse progettazioni specifiche per l'applicazione: Nel design T-SPIM, il campione viene illuminato da due ottiche contrapposte per ottenere un risultato più uniforme. Il design del X-SPIM viene così ottenuto grazie all'aggiunta di un secondo percorso di rilevamento.

Il progetto Flamingo e i microscopi che ne derivano sono stati ideati da Jan Huisken e dal suo gruppo al >> Morgridge Institute for Research di Madison, WI. PI è uno degli sponsor del Progetto Flamingo.

Maggiori informazioni sono disponibili nel nostro >> blog.

Modular concept of FLAMINGO: PI’s linear and rotation stage modules are depicted on the right — Concetto modulare di FLAMINGO: I moduli degli assi lineari e di rotazione del PI sono rappresentati a destra (Immagine: Morgridge Institute for Research, Madison, WI)

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